Nasi Partnerzy 1 Kontakt 1 Mapa Strony

Stowarzyszenie Winiarzy Ma這polskiego Prze這mu Wis造

W poszukiwaniu rodzic闚 czyli nowoczesna ampelografia

Markery DNA w ampelografiiWsp馧czesne metody ampelografii wykorzystuj帷e metody biologii molekularnej pozwalaj na identyfikacj odmiany winoro郵i, ustalenie jej odmian rodzicielskich, a ich wyniki praktycznie nie pozostawiaj 瘸dnych w徠pliwo軼i co do stopnia pokrewie雟twa genetycznego. Ma to znaczenie nie tylko w przypadku, kiedy ta sama odmiana wyst瘼uje pod r騜nymi nazwami, ale r闚nie przy tworzeniu nowych odmian, ich klasyfikacji, jak i ochronie prawnej. Na czym polegaj badania genetyczne, rutynowo ju dzi stosowane w ampelografii? To nic innego jak mapowanie genomu, czyli "narysowanie" mapy genomowej danego organizmu. Jak ka盥y rodzaj mapy, r闚nie i mapa genetyczna okre郵a obecno嗆 i wzajemne relacje jej sk豉dnik闚, w tym przypadku pozycje poszczeg鏊nych gen闚 w stosunku do okre郵onych wyznacznik闚, czyli marker闚. Na mapie geograficznej takimi wyznacznikami s sk豉dniki krajobrazu, jak rzeki czy drogi. W przypadku mapy genetycznej, wyznacznikami mog by ca貫 geny, jak i okre郵one kr鏒kie charakterystyczne odcinki DNA nie bed帷e genami, tzw. markery DNA. I to w豉郾ie te drugie maj dzi zasadnicze znaczenie w filogenetyce, a w鈔鏚 nich tzw. markery drugiej generacji (ang. second generation) oparte na polimorfizmie (wieloodmianowo軼i) gen闚.

Klasyczna ampelografia opiera豉 si na analizie cech zewn皻rznych winoro郵i (np. barwa czy wielko嗆 li軼i, owoc闚), kt鏎e mog podlega zmianom pod wp造wem czynnik闚 鈔odowiskowych. Stosowana dzi analiza genetyczna oparta jest na analizie sekwencji DNA, kt鏎a jest sta豉 i niezmienna, niezale積ie od tego, gdzie i w jakich warunkach klimatycznych dana odmiana winoro郵i ro郾ie. Polega ona na tworzeniu tzw. profili DNA, czyli jakby "odcisk闚 palca" (ang. fingerprint) winoro郵i. Taki profil DNA okre郵a stopie pokrewie雟twa genetycznego i mo瞠 by u篡ty np. w dochodzeniu s康owym jako dow鏚 to窺amo軼i odmiany, podobnie jak wyniki analiz DNA s dopuszczane przy ustalaniu sprawc闚 przest瘼stw kryminalnych lub potwierdzaniu ojcostwa. W sekwencji nukleotyd闚 (A, G, C, T) wsp馧tworz帷ych DNA zapisana jest informacja genetyczna, i to w豉郾ie okre郵one sekwencje nukleotyd闚 stanowi istot marker闚 DNA. Oznaczenia filogenetyczne polegaj w tym przypadku na stwierdzeniu obecno軼i lub braku markera, a w przypadku jego obecno軼i r闚nie na jego zmapowaniu - czyli zaznaczeniu punktu jego wyst瘼owania na mapie genomowej odmiany. Por闚nuj帷 mapy genomowe r騜nych odmian winoro郵i, okre郵a si ich wzajemne zale積o軼i, ewentualne powi您ania genetyczne lub te ich brak. Na przyk豉d w ten spos鏏 Carole Meredith z University of California wykaza豉, 瞠 uznawane wcze郾iej za r騜ne odmiany Zinfandel, Primitivo, Crljenak Kaśtelanski s identyczne, podobnie jak Charbono i Corebeau. R闚nie badania z u篡ciem marker闚 DNA wykaza造, 瞠 winoro郵 w Europie jest ma這 zr騜nicowana pod wzgl璠em genetycznym (9-15% zr騜nicowania), sugeruj帷, 瞠 uprawiane odmiany winoro郵i reprezentuj jedn kompleksow pul genow, a ich odmienno嗆 wynika raczej z faktu selekcji dokonanej przez cz這wieka, ani瞠li z geograficznego 廝鏚豉 pochodzenia i selekcji naturalnej.

Do przeprowadzenia genetycznej identyfikacji odmiany winoro郵i potrzebne jest laboratorium pos逝guj帷e si technikami biologii molekularnej (specjalistyczny sprz皻 i odczynniki, pe軟a sterylno嗆), co w zasadzie jest ju bardzo popularne, r闚nie w Polsce. Z technicznego punktu widzenia, analiz tak mo積a wykona do嗆 szybko; jest szansa, 瞠 wynik uzyskamy w ci庵u kilku dni od rozpocz璚ia analizy. Z naszej strony wystarczy, 瞠 dostarczymy materia do bada w postaci np. li軼ia winoro郵i, czy te skrawka podk豉dki - bo r闚nie i te mo瞠my w ten spos鏏 zidentyfikowa.

Jak przebiega badanie stwierdzaj帷e obecno嗆 markera i jego lokalizacji? W zale積o軼i od typu markera, stosowane s r騜ne podej軼ia. St康 te na pocz徠ku okre郵a si, w kierunku jakich marker闚 chcemy zbada genom okre郵onej winoro郵i. Przy weryfikacji rodzicielstwa czy ustalaniu odmiany wystarczy analiza kilku marker闚 by uzyska niepodwa瘸lne wyniki. W pracach, gdzie analizie poddaje si kilkana軼ie lub kilkadziesi徠 marker闚, celem jest juz raczej ustalenie rodowodu danej odmiany, a nie stwierdzenie samego rodzicielstwa czy weryfikacja genetycznej zgodno軼i odmiany. Dzi w oryginalnych pracach ampelograficznych zasadnicze znaczenie maj wspomniane ju markery DNA oparte na polimorfizmie genetycznym, w tym szczeg鏊nie: RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism), SSLP (ang. simple sequence length polymorphism) - oparte na polimorfizmie d逝go軼i prostych sekwencji DNA oraz SNP (ang. single nucleotide polymorphism) - oparte na polimorfizmie punktowym. Powszechna jest r闚nie metoda RAPD (ang. random amplification of polymorphic DNA) - losowej amplifikacji (powielania) polimorficznych fragment闚 DNA.

We wszystkich tych metodach (poza SNP) w pewnym momencie analizowany DNA jest rozdzielany w polu elektrycznym na 瞠lu agarozowym. Zdj璚ia 瞠l闚 agarozowych z rozdzielonym DNA stanowi cz瘰ty element graficzny materia堯w promocyjnych firm przeprowadzaj帷ych testy genetyczne i warto przy okazji u鈍iadomi sobie, co tak naprawd kryje si pod tymi tajemniczymi obrazkami. W metodzie tej fragmenty DNA jako cz御tki elektrycznie nieoboj皻ne w璠ruj w polu elektrycznym i rozdzielone zostaj w zale積o軼i od ich wielko軼i. 疾l agarozowy w tym przypadku dzia豉 jak grube sito - ma貫 fragmenty 豉two i szybko przechodz (w璠ruj) przez nie, podczas gdy du瞠 - o wiele trudniej i wolniej. W efekcie, posegregowane fragmenty DNA tworz obraz pr捫kow na 瞠lu, gdzie ka盥y pr捫ek odpowiada fragmentowi DNA o okre郵onej wielko軼i. Typowy obraz 瞠lu agarozowego z uwidocznionymi przy u篡ciu bromku etydyny pr捫kami DNA rozdzielonymi w polu elektrycznym pokazany jest poni瞠j (Rys.1):

Badania DNA w ampelografiiRysunek 1: 疾le agarozowe (zdj璚ia w 鈍ietle UV, z archiwum autorki) z rozdzielonym elektroforetycznie (w polu elektrycznym) DNA. Zasada jest prosta - ka盥y widoczny pr捫ek odpowiada fragmentowi DNA. Kierunek w璠r闚ki pr捫k闚 jest pionowy (z g鏎y na d馧). Pr捫ki znajduj帷e si najwy瞠j maj najwi瘯sz d逝go嗆 (w璠ruj najwolniej), natomiast te najni瞠j - najmniejsz d逝go嗆 (w璠ruj najszybciej); pr捫ki znajduj帷e si na jednym poziomie maj podobn d逝go嗆 sekwencji DNA.

RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism) w tym przypadku mo積a por闚na do biometrycznego dowodu to窺amo軼i czy po prostu do biometryki odmiany. Przygotowanie takiej metryki polega na wyizolowaniu z li軼ia b康 innej cz窷ci winoro郵i DNA i poci璚iu go odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, kt鏎e maj t w豉軼iwo嗆, 瞠 tn DNA w obr瑿ie 軼i郵e okre郵onych miejsc rozpoznawanych przez dany enzym. W efekcie takiego ci璚ia powstaje ca造 zbi鏎 fragment闚 DNA, kt鏎ych ilo嗆 i d逝go嗆 jest charakterystyczna dla danej odmiany. Fragmenty te poddaje si nast瘼nie wy瞠j opisanemu rozdzia這wi elektroforetycznemu, wykorzystuj帷 w豉軼iwo嗆 r騜nej szybko軼i poruszania si fragment闚 DNA w zale積o軼i od ich wielko軼i. W efekcie uzyskujemy wz鏎 osobniczy danej odmiany, tzw. "odcisk palca" w postaci zestawu pr捫k闚 rozdzielonych na 瞠lu, kt鏎y swoim wygl康em jest podobny do elektronicznego kodu kreskowego. Analogicznie jak i w kodzie kreskowym, r闚nie i w obrazie pr捫kow DNA na 瞠lu, zakodowane s wszystkie informacje o odmianie, jej pochodzeniu, sk豉dzie biochemicznym, sk這nno軼i lub oporno軼i do chor鏏 itp. W celu wyszukania charakterystycznej sekwencji DNA, kt鏎a warunkuje np. cech odmianow lub podatno嗆 na dan chorob, rozdzielone fragmenty DNA przenosi si na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzuje si z sondami (zsyntetyzowany fragment DNA komplementarny do poszukiwanego fragmentu). Uzyskany obraz pr捫k闚 DNA por闚nuje si nast瘼nie z obrazem referencyjnym. Obraz RFLP nie bez powodu nazywany jest "odciskiem palca" - jest on 軼i郵e okre郵ony dla danego szczepu, i tak jak w przypadku odcisku palca, nie ma dw鏂h os鏏 o takim samym uk豉dzie linii papilarnych, tak nie ma dw鏂h osobnik闚 o takim samym profilu RFLP.

Kolejne metody oznacze rodzicielstwa b康 ca貫go drzewa genealogicznego danej odmiany wykorzystuj dodatkowo tzw. metod PCR (ang. polymerase chain reaction) - czyli 豉鎍uchow reakcj polimerazy. To nic innego jak metoda powielania (namna瘸nia) 豉鎍uch闚 DNA w warunkach laboratoryjnych. Kluczow spraw s tutaj kr鏒kie, laboratoryjnie zsyntetyzowane fragmenty DNA (tzw. oligonukleotydy lub startery, ang. primers), kt鏎e s komplementarne do sekwencji okalaj帷ej powielany w reakcji PCR fragment DNA. W efekcie, dysponuj帷 znikom ilo軼i DNA, mo瞠my go namno篡c do potrzebnych nam ilo軼i. Metoda, za kt鏎 Kary Mullis otrzyma w roku 1993 Nagrod Nobla, jest dzi rutynowo stosowana w laboratoriach biologii molekularnej na ca造m 鈍iecie, i to g堯wnie za jej spraw dysponujemy dzi nowoczesnymi markerami genetycznymi, dzi瘯i kt鏎ym z ko鎍em XX wieku nast徙i prawdziwy prze這m w ampelografii.

Marker SSLP (ang. simple sequence length polymorphism) to nic innego jak powtarzaj帷y si tandemowo (jeden za drugim) okre郵ony motyw sekwencji nukelotyd闚 DNA. Przyk豉dowo, takim motywem mo瞠 by para czy tez tr鎩ka nukleotyd闚, np. AT, GGT. Same za powt鏎zenia motyw闚 s r騜nej d逝go軼i w allelach (odmianach) poszczeg鏊nych gen闚. W鈔鏚 SSLP, szczeg鏊ne znaczenie maj tzw. minisatelity i mikrosatelity (SSR, ang. single sequence repeat), kt鏎e r騜ni si d逝go軼i sekwencji DNA. W przypadku minisatelit闚, jednostka powtarzalna (motyw) ma kilkadziesi徠 nukleotyd闚 d逝go軼i (5-60 par zasad), natomiast w przypadku mikrosatelit闚 jednostka powtarzalna jest kr鏒ka, sk豉da si przewa積ie z dwu-, trzy- lub czterech nukleotyd闚, jak np. (AT)n, (GGT)n, (GACA)n. W przypadku minisatelit闚 liczba powt鏎ze motywu wynosi od 2 do 1000, w przypadku mikrosatelit闚 od 10 do 50. Jako markery DNA, mikrosatelity s bardziej popularne ni minisatelity z dw鏂h przyczyn. Po pierwsze, minisatelity nie s r闚no rozprzestrzenione w genomie, cz窷ciej znajduje si je na ko鎍ach chromosom闚 (struktura bia趾owo-nukleinowa, w kt鏎ej upakowane jest DNA), co powoduje 瞠 trudniej jest je zlokalizowa. Poza tym, technika PCR stosowana do wyszukiwania polimorfizmu z wykorzystaniem marker闚 SSLP lepiej sprawdza si w przypadku kr鏒szych sekwencji nukleotydowych (do 300 bp, ang. base pair, oznaczaj帷ych pary zasad DNA) jak mikrosatelity (zwykle do 150 bp) ni d逝窺zych, jakie potrafi osi庵a DNA minisatelitarny (np. setki powt鏎ze kilkunastonukleotydowego motywu). Wraz z powstaniem projektu IGGP, (ang. International Grapevine Genome Project, www.vitaceae.org), naukowcy zajmuj帷y si winoro郵 maj dost瘼 do najbardziej popularnych narz璠zi bioinformatycznych u篡wanych w tej dziedzinie, jak np. opublikowanych baz danych mikrosatelit闚 (SSR). Przyk豉dowo, dzi瘯i markerom mikrosatelitarnym John Bowers i Carole Meredith z University of California zidentyfikowali pochodzenie Cabernet Sauvignon, kt鏎y okaza si by "dzieckiem" Cabernet Franc i Sauvignon Blanc. Jakkolwiek bliskich relacji pomi璠zy Cabernet Sauvignon i Cabernet Franc mo積a by這 si spodziewa, tak bezpo鈔ednie rodzicielstwo Sauvignon Blanc w tym przypadku by這 pe軟ym zaskoczeniem.

Markery RAPD (ang. random amplification of polymorphic DNA) - oparte s na losowej amplifikacji (powielaniu) polimorficznych fragment闚 DNA przy u篡ciu reakcji PCR, i tak jak inne wymienione, r闚nie i te s wykorzystywane w analizie podobie雟twa, wzajemnych relacji i pochodzenia odmian winoro郵i. W metodzie nie potrzebujemy 瘸dnej znajomo軼i sekwencji DNA analizowanej winoro郵i, a kluczow rol odgrywa tu jeden losowo dodany starter oligonukleotydowy o du瞠j ilo軼i par zasad G i C. Poniewa DNA r騜nych szczep闚 ro積i si miedzy sob, po rodzieleniu na 瞠lu (patrz wy瞠j) uzyskujemy wz鏎 pr捫kow DNA charakterystycznych dla ka盥ego z analizowanych szczep闚 winoro郵i. Podobie雟two wzor闚 uzyskanych w tym te軼ie pozwala na ocen pokrewie雟twa badanych szczep闚 winoro郵i.

Markery SNP (ang. single nucleotide polymorphism) oparte s na mutacjach punktowych - czyli r騜nicach w obr瑿ie jednego nukleotydu (!) Zalet SNP jest ich olbrzymia liczba w genomie, ewolucyjna stabilno嗆 (brak zmian z pokolenia na pokolenie), wysoka wydajno嗆 identyfikacji i szybko嗆 oznaczenia (oznaczenia przeprowadza si bez analizy w 瞠lu agarozowym). Detekcja SNP jest szybka i odbywa si na zasadzie hybrydyzacji z oligonukleotydami, wykorzystuje tzw. technologi "chip" DNA. "Chip" DNA to nic innego jak p造tka z wieloma rodzajami nukleotyd闚. Wyznakowany znacznikiem fluorescencyjnym testowany DNA nanosi si na p造tk, a ewentualn hybrydyzacj ogl康a si pod mikroskopem fluorescencyjnym. Pomimo relatywnie wysokich koszt闚 (ze wzgl璠u na koszt "chipa", ale i te znacznik闚 fluorescencyjnych), metoda staje si coraz popularniejsza, a w oryginalnych pracach ampelograf闚 jest ju rutynowo stosowana. Obecnie dysponujemy ju setkami zlokalizowanych marker闚 SNP w genomie winoro郵i, kt鏎e zebrane s w og鏊nodost瘼nych bazach (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov), a efektem tego s ju do嗆 szczeg馧owe mapy genomowe Vitis spp. oparte na w/w markerach. Dysponujemy ju bardzo szczeg馧owymi fizycznymi mapami genomowymi dla Cabernet Sauvignon i Pinot Noir (http://genomics.research.iasma.it), jak i wysokiej jako軼i sekwencj genomu Pinot Noir. Analiza sekwencji Pinot Noir odkry豉 niezliczon ilo嗆 SNP w obr瑿ie genomu winoro郵i, a wykorzystanie narz璠zi bioinformatycznych (program闚 komputerowych, baz danych) umo磧iwia genetyczn analiz por闚nawcz ka盥ego szczepu, niezale積ie od tego czy jego sekwencja genomu jest znana. W bazach genomowych zawarte s r闚nie wszystkie dost瘼ne informacje na temat marker闚 DNA, jak sekwencja, lokalizacja na chromosomie, warunki reakcji PCR w jakich nale篡 przeprowadzi jego analiz. Zbadanie genomu winoro郵i w kierunku kilku marker闚 SNP ca趾owicie wystarcz do okre郵enia pokrewie雟twa genetycznego, cho cz瘰to w pracach ampelograficznych spotyka si badania w kierunku kilkunastu, czy te kilkudziesi璚iu marker闚. Badania takie maj jednak na celu bardziej skonstruowanie ju mapy genomowej danego szczepu, w kt鏎ej ilo嗆 zlokalizowanych marker闚 przedk豉da si w prostej zale積osci na jej rozdzielczo嗆.

Jakie korzy軼i z powy窺zych technik wynikaj dla winoro郵arzy? Przede wszystkim, dzisiejsza ampelografia praktycznie bez cienia w徠pliwo軼i potrafi rozwi您a zagadki je郵i chodzi o rodzaj i pochodzenie szczep闚. To samo dotyczy podk豉dek. Ma to du瞠 znaczenie w rejonach, gdzie winoro郵 ro郾ie od lat, jak r闚nie na terenach, gdzie dana odmiana zosta豉 zaadaptowana z innych region闚, i w takich przypadkach cz瘰to ta sama odmiana wyst瘼uje pod kilkoma nazwami. Co wi璚ej, okre郵enie pochodzenia winoro郵i ma ogromne znaczenie w hodowli. Na przyk豉d znaczenie z pozoru nieciekawej odmiany Gouais blanc gwa速ownie wzros這, gdy okaza這 si, 瞠 jest ona, razem z Pinot odmian rodzicielsk w stosunku do wielu wa積ych odmian francuskich, w tym do Chardonnay. Badania taksonomiczne stanowi istotne 廝鏚這 informacji pozwalaj帷ych zoptymalizowa wykorzystanie istniej帷ych zasob闚 genowych na przyk豉d poprzez wybranie najodpowiedniejszych form do krzy穎wa oddalonych. Poza tym wytworzenie nowej odmiany winoro郵i jest procesem d逝gotrwa造m, trwaj帷ym kilkana軼ie lat. Cykl hodowlany mo積a znacznie skr鏂i prowadz帷 selekcj z wykorzystaniem marker闚 DNA. W tym celu wykorzystuje si bezpo鈔edni analiz DNA b康 te istnienie bliskiego sprz篹enia pomi璠zy markerem a locus (lokalizacj) odpowiedzialnym za dziedziczenie cechy u篡tkowej. Metoda ta cz瘰to jest okre郵ana skr鏒em MAS (ang. marker-assisted selection) i ma szerokie zastosowanie w hodowli winoro郵i. Na przyk豉d, znaj帷 marker sprz篹ony z genem warunkuj帷ym odporno嗆 owoc闚 na okre郵one patogeny, mo積a prowadzi selekcj w tym kierunku jeszcze na kilka lat przed wej軼iem winoro郵i w pe軟y okres owocowania (co licz帷 od posadzenia sadzonki trwa oko這 5 lat). Ponadto, techniki genetycznej identyfikacji winoro郵i mog by bardzo u篡teczne, je郵i chodzi o walk z odmianowym "piractwem". Prawo hodowcy do korzystania z przywilej闚 w豉snej odmiany rozci庵a si na odmiany pochodne i przy u篡ciu powy瞠j opisanych technik r闚nie bez problemu mo積a stwierdzi, czy dana odmiana jest rzeczywi軼ie odmian now, czy te tzw. pochodn, tzn. zgodn z odmian wyj軼iow pod wzgl璠em istotnych cech. R闚nie i w tym przypadku "odcisk palca" DNA winoro郵i mo瞠 by bardzo u篡teczny.


(tekst i grafika Daria S這wik)


Dodano 3.03.2009

Poprzednia wiadomo嗆

Nast瘼na wiadomo嗆








Zamek w Janowcu n/Wisł - siedziba Stowarzyszenia Winiarzy Małopolskiego Przełomu Wisły
Markery genetyczne w ampelografii. Winiarze MPW.